星状细胞及其相关炎症分子与肝细胞癌转移复发的关系研究

【摘要】肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是一种常见的恶性肿瘤,占整个肝癌的70-85%和全世界癌症死亡原因的第三位。在我国,自20世纪90年代,其以发展成第二位的癌症杀手。高死亡率通常与早期诊断和治疗选择的局限性有关。事实上,HCC早期临床表现的隐蔽性、特异监测标志的缺乏和现有治疗策略的不足均限制了其预后的进一步改善。而目前即使采取最有效的手术根治性切除,5年的术后复发转移率仍超过60%。因此,如何准确的预测预后、降低患者的术后复发转移,进行有效的靶向干预治疗,已经成为亟待解决的问题。大量证据显示,HCC是一个典型的炎症相关的癌症,主要由于受肝炎病毒感染和肝硬化所致。HCC的慢性炎症是复杂的肿瘤微环境的重要组成之一,包括大量炎症/免疫细胞和介质。因此,在很大程度上,HCC转移的生物学行为和恶性预后可能被局部的炎症状态所决定和影响。一些证据提示,在肝癌形成过程中,炎症／免疫细胞活化,并相互协作,获得促瘤活性,从而导致肿瘤的恶性后果。就此而言,这些炎症/免疫细胞和它们所表达的一些关键介质,可能提供了HCC靶向治疗的靶点。而值得关注的是,肝星状细胞(HSCs)活化后,能展示其多变的表型和致纤维化的特性。HSCs在肿瘤微环境中的作用已经开始获得广泛关注。有研究认为,在肿瘤微环境中,HSCs是一种被癌细胞旁分泌因子刺激后,分化为癌相关肌成纤维细胞(CAMFs)的窦周成纤维细胞。一方面,HSCs中的某些活化信号,如转化生长因子(TGF)-β、肝细胞生长因子(HGF)和血小板源性生长因子(PDGF)在肿瘤发展和纤维化过程中都起了重要作用。另一方面,HSCs被肿瘤细胞直接诱导活化后,通过肿瘤一间质相互作用的分子网络,促进血管形成、侵袭和转移。虽然我们已获知上述这些关于HSCs在肿瘤发展中所涉及到的机制,但关于HSCs促进HCC转移复发的本质和调节仍然知之甚少。在本项研究中,我们首先从肝癌微环境中HSCs的水平,利用组织和基因微阵列技术,比较分析了癌旁HSCs与对应的肝癌CAMFs的全基因表达谱差异,以及几个最具特征的HSCs的表型标志在HCC组织中的表达水平和患者转移复发的联系；接着,我们以HSCs基因表达谱的分析结果为基础,从中筛选出差异表达明显的炎症因子,如TREM-1,作为研究对象,探讨了其作为功能基因,协同HSCs促进肿瘤细胞迁徙的机制,并建立了TREM-1与HCC患者预后的关系；最后,通过HSCs基因表达谱,我们发现了IL-17受体在HSCs中表达。为进一步了解HSCs与炎症／免疫细胞之间的关系,我们研究了肿瘤活化的HSCs和IL-17+CD4+T细胞之间的相互作用,从而在一定程度上验证了肿瘤微环境中各种炎症／免疫细胞间具有相互“交流”,促肿瘤发展的作用和能力。第一部分免疫微环境中肿瘤活化肝星状细胞的基因表达谱研究本研究旨在通过HSCs的基因谱特征和表型分析,探讨其在肝癌局部微环境中的表型变化、数目、分布部位和基因表达水平的差异,从而寻找针对HBV相关性HCC的预后和治疗靶点有关的有效信息,以进一步研究以HSCs为代表的间质细胞在免疫微环境和肝癌复发转移中所起的作用。本研究中,我们随机选取224例2007年在复旦大学附属中山医院肝外科行根治性手术切除的HBV相关的HCC患者。首先,我们利用免疫组织化学和细胞定量的方法评价了5个具有代表性的HSCs表型标志在这些患者肝癌组织中的表达水平,包括a-SMA、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、结蛋白(Desmin)、粘着斑蛋白(Vinculin)和波形蛋白(Vimentin);及其和HBV相关的HCC患者术后肿瘤转移复发及肿瘤侵袭能力的联系；接着,利用流式细胞术,检测了体外HCC条件培养基(TCM)对HSCs细胞株LX-2的表型变化的影响(GFAP、纤维连接蛋白、CD56和白介素17受体)；最后,我们分别从正常／癌旁肝组织和癌组织中分离出HSCs和癌相关性肌成纤维细胞(CAMFs),进行全基因表达谱分析。结果发现：(1)Desmin和GFAP在肝细胞癌患者的肝组织中均呈阴性表达；Vinculin和Vimentin则广泛表达在癌旁和癌内组织的间质和实质细胞中；α-SMA在癌内和癌旁组织中均只在间质细胞中表达,阳性染色细胞形态不规则,呈梭型或星型。(2)癌旁α-SMA阳性HSCs的表达水平与肿瘤大小(P=0.015)、肿瘤分化(P=0.002)和TNM分期(P=0.028)正相关；单因素和多因素Cox生存分析均证实,癌旁α-SMA阳性HSCs与HBV相关性HCC患者的至复发时间(TTR,timetorecurrence)和总生存时间(OS,overallsurvival)相关,尤其是对早期复发和AFP正常的HCC患者具有预测价值(P均<0.05)；癌旁和癌内的Desmin、GFAP、Vinculin和Vimentin以及癌内α-SMA表达水平与HCC的预后无显著相关性(OS和TTR的P>0.05)。(3)经3种HCC细胞株(MHCC97L、HCCLM3和HCCLM6)的条件培养基(TCM)刺激后,GFAP+HSCs细胞株LX-2比例显著降低(P<0.05),而其他表型标志(纤维连接蛋白、CD56和IL-17R)无明显变化。(4)基因表达谱结果分析,与静止型HSCs比较,癌旁HSCs和癌内CAMFs均有大量基因发生显著上调和下调(P<0.05),这些调节基因多与生物学过程、细胞组成和分子功能有关,并涉及纤维化、炎症和癌症发展有关的信号通路；最后通过选取的一些基因进行实时定量PCR,验证了该基因芯片的可靠性。以上结果表明,HSCs是构成免疫微环境中不可或缺的一种炎症细胞,在炎症反应和肿瘤微环境中,其表型和功能基因多变,导致其从静止状态向活化状态,直至肌成纤维样细胞之间的转变,进而与各种免疫活性细胞和肿瘤细胞相互作用,发挥其促瘤作用。癌旁活化的HSCs越多,患者预后越差,也说明HSCs在肝癌转移复发中的重要作用。通过综合评价HSCs的基因表达,数目、分布等,可以准确把握肝癌局部免疫状态,也提示其作为有用的HCC风险性生物指标和肝癌免疫靶向治疗的潜在价值。第二部分TREM-1在肝星状细胞中的表达及与肝细胞癌的预后关系研究本研究旨在通过HSCs中表达的炎症因子TREM-1的研究(通过基因表达谱筛选,见第一部分),探讨炎症细胞与肿瘤预后之间联系,并以此为基础研究肿瘤免疫微环境中,炎症细胞通过释放各种炎症信号,产生级联放大反应,进而动态调控促炎反应向促瘤方向转化的机制。本研究中,我们通过酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测了HSCs被LPS或HCC细胞株条件培养基刺激后细胞上清中可溶性TREM-1(sTREM-1)的表达水平,以及总共92例恶性和/或良性肝肿瘤/肝病血浆中可溶性sTREM-1的表达水平；借助免疫组织化学和细胞定量,评估TREM-1在总共240例HCC患者(包括检测组和验证组)肝切除组织构建的组织微阵列中的表达情况,通过生存分析,研究了TREM-1阳性细胞的分布、数目与肿瘤转移复发的关系。结果发现：(1)TREM-1在大多数癌内和癌旁组织均为阳性表达,且在癌细胞和肝细胞的细胞质中表达。免疫荧光和细胞化学也证实其在活化的HSCs和CAMFs中高表达。(2)活化HSCs与HCC细胞株或正常肝细胞株共培养后,细胞上清液中sTREM-1、IL-6和TNF-α的表达水平显著增加(P<0.001);LPS刺激30分钟以后(10μg/ml-lng/ml),从HSCs/CAMFs培养上清检测到增加的sTREM-1水平,活化HSCs/CAMFs分泌sTREM-1的峰值在1-2小时,LPS以时间依赖性的方式,而非剂量依赖性诱导了sTREM-1从活化HSCs/CMAFs中的分泌；(3)TREM-1激动剂/抑制剂诱导HSCs/CAMFs活化后收集的条件培养基,明显改变了HCC的迁移能力；(4)与良性肝肿瘤比较,HCC患者血清中的sTREM-1、IL-6和TNF-α表达水平显著增加(P<0.005)；(5)在检测组中,癌旁TREM-1的密度与血管侵袭(P<0.001)、肿瘤大小(P=0.001)和TNM分期晚期(P<0.001)显著相关；单因素分析显示癌旁高密度的a-SMA和TREM-1与较短的OS(P均<0.001)和TTR(P均<0.001)显著相关；多因素分析进一步证明,增加的癌旁a-SMA和TREM-1能够预测患者的OS(P=0.009和0.008)和增加的复发风险(P=0.015和0.005)。癌旁TREM-1高表达水平更易与早期复发联系在一起(单因素P<0.001和多因素P=0.006),而不是晚期复发。验证组获得了与检测组一致的结果,即癌旁高密度的TREM-1与较短的OS(P<0.001)和TTR(P=0.002)紧密联系在一起。以上结果提示,以HSCs为例的间质细胞在免疫微环境和肝癌的转移复发中具有重要的作用。通过它们所表达的一些炎症信号或通路的作用,发生级联放大反应,扩大微环境中的炎症反应,从而进一步强化了肿瘤的恶性生物学行为,促进了癌细胞的侵袭和转移。TREM-1作为其中的一个炎症信号,参与了与肿瘤的侵袭行为,可以作为一个潜在的HCC预后预测因素以及抗肿瘤治疗中的潜在抗炎靶点。第三部分IL-17/IL-17RE与肝星状细胞及肝细胞癌预后的关系研究本研究旨在通过研究不同炎症间质细胞之间(HSCs和Th17)的相互作用,初步探讨在肿瘤微环境中,炎症信号作为不同炎症细胞之间“交流”的媒介,并协同作用,促进肿瘤转移复发的可能性,为进一步深入进行各种炎症细胞与肿瘤细胞之间的调控奠定基础。通过第一部分中HSCs的基因表达谱,我们证实了几个IL-17受体(如,IL-17RA、RB和RE)在HSCs中的表达,因而我们选择了IL-17受体作为研究对象。本研究中,我们通过300例HCC术后切除的组织标本,构建了组织微阵列,利用免疫组织化学和细胞定量的方法,检测了IL-17和IL-17R(A-E)家族成员的表达情况,并评价了它们对HCC患者预后的预测能力；通过ELISA,检测了111例HCC患者血清中6个Th17相关性细胞因子(IL-6、-9、-17、-22、-17R和TNF-a)的表达水平；用流式细胞术检测HSCs条件培养基对IL-17+CD4+T细胞体外增殖的影响。结果发现：(1)IL-17受体家族成员在各种肝细胞和癌细胞中呈局灶性、分散性和弥漫性表达,显示出不同的染色模式：IL-17RA和IL-17RB非常相似,在肝组织中的表达呈弥漫性分布；IL-17RC的表达在癌内和癌旁组织均较弱；除了肝实质细胞,IL-17RD和IL-17RE均以相似的染色模式表达在间质细胞；(2)癌旁IL-17RE的密度与血管侵袭(P=0.004)和TNM分期的晚期(P=0.012)相关,没有临床病理指标与癌内的IL-17RE和IL-17有关。癌旁和癌内IL-17RE的密度均与TTR和OS显著相关(P均<0.001)。癌内的IL-17密度是一个独立的预测因素。ROC分析表明癌内IL-17RE和IL-17密度组合对于HCC患者的临床预后的预测价值较单独指标,更具准确性。二者密度的组合能够预测早期复发和晚期复发；(3)在HCC患者血清中,IL-6、-22、-17R和TNF-a表达水平较肝血管瘤患者明显增加(P<0.001),术后5天,所有这些指标的表达水平均显著降低(P<0.001)；(4)利用癌旁活化HSCs的条件培养基培养后,HCC患者和肝血管瘤患者外周血中的IL-17+CD4+和IL17+CD3+T细胞的比例显著增加了(P<0.01)。未刺激的IL-17+CD4+和IL17+CD3+T细胞比例无统计学差异(P>0.05)。以上结果表明,肿瘤微环境中,各种炎症细胞之间可能存在相互“交流”,它们分泌或表达的细胞因子或受体为它们构建了联系的桥梁。不同类型炎症细胞之间的协同作用,可能改变了肿瘤微环境的稳态,动态调节了肿瘤的发展方向。如同本研究中的IL-17和IL-17RE,是肝癌转移复发过程中的重要组成部分,也为我们提供了有用的监测高危患者的指标和干预靶点进行靶向治疗。结论1基因表达谱分析结果显示,与静止型HSCs比较,癌旁HSCs和癌内CAMFs均有大量基因发生显著上调和下调,这些调节基因多与生物过程、细胞组成和分子功能有关,并涉及纤维化、炎症和癌症发展有关的信号通路；2癌旁α-SMA阳性HSCs与HBV相关性HCC患者的TTR和OS相关,尤其是对早期复发和AFP正常的HCC患者具有预测价值；3TREM-1在癌细胞、肝细胞和HSCs中表达,癌旁TREM-1的表达水平能够预测患者的TTR和OS,其高表达水平更易与早期复发联系在一起,而不是晚期复发。4癌旁和癌内IL-17RE的密度均与TTR和OS显著正相关。癌内IL-17的密度也是一个独立的预测因素。癌内IL-17RE和IL-17的密度组合对于HCC患者的临床预后的预测价值较单独指标,更具准确性。创新点1首次分析和报道了HCC中癌旁活化的HSCs和癌内CAMFs的基因表达谱,发现大量变化的功能基因,通过对这些基因的研究可以准确把握肝癌局部免疫状态,也提示其作为有用的HCC风险性生物指标和肝癌多项靶点治疗的潜在价值。2首次发现并报道了TREM-1不仅表达在髓样细胞中,也表达在肝细胞、肝癌细胞和HSCs中,癌旁TREM-1的表达水平可以作为HCC术后切除转移复发的独立指标,显示了其作为一个HCC预后预测因素以及抗肿瘤治疗中的抗炎靶点的潜在价值。3首次证实癌旁和癌内的IL-17RE在HCC术后患者中的预测能力,并证实了炎症/免疫细胞之间相互作用促进增殖。潜在应用价值1肝癌肿瘤微环境中的多种炎症/免疫细胞(如HSCs和Th17)的密度与患者术后的转移复发紧密相关,可以用于作为监测HCC风险的生物指标和肝癌靶向治疗的靶点。2从肝癌肿瘤微环境中炎症/免疫细胞的基因表达谱分析中,能发现大量的变化调节基因,通过对这些基因数据的挖掘及整合,可以用于建立一套完整的HCC风险预测模型,并指导个体化治疗的实施。
【作者】廖锐；
【导师】邱双健；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】肝细胞癌；肿瘤微环境；炎症；复发和转移；预后；肝星状细胞；髓样细胞触发性受体-1；白介素17；受体；Th17细胞；

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